Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor bienzimático confeccionado com as enzimas glicose oxidase e frutose dehidrogenase, imobilizadas em camadas auto-organizadas de cistamina, para a quantificação de açúcares em alimentos. O desempenho do dispositivo mostrou-se eficiente para a determinação de açúcares em matrizes de alimentos, apresentando uma resposta rápida, além da eliminação do efeito da matriz. Adicionalmente, comparando-se a metodologia desenvolvida neste trabalho com os dados da literatura, observou-se que os limites de detecção, obtidos com o biossensor bienzimático, foram menores que os valores obtidos por meio de um procedimento comercial de determinação de carboidratos, utilizando a técnica de HPLC. Outra vantagem inerente foi a aplicação do biossensor em amostras de alimentos, a fim de verificar a potencialidade deste sensor, o qual promoveu resultados consideráveis em termos das menores quantidades detectáveis dos açúcares em estudo. Estes aspectos são pouco relatados na literatura e constituem uma vantagem característica do sistema desenvolvido neste estudo, bem como uma contribuição importante na área da eletroanálise.